Сервис для
сео - оптимизаторов

Найди ошибки на сайте
Ошибки мешают продвижению сайта
Исправь ошибки на сайте
Сайт без ошибок продвигать легче
Получи новых клиентов
Новые клиенты принесут больше прибыль

Дифференциальные транскрипционные ответы на вирусную инфекцию Эбола и Марбург в клетках летучей мыши и человека

  1. Различия в ранней скорости репликации вируса Сравнивая уровни вирусной РНК в клетках HuH7 и R06E-J,...
  2. Регуляция транскрипционных факторов
  3. Противовирусный ответ мРНК в основном не изменяется
  4. Большинство генов хозяина демонстрируют сходную реакцию после заражения EBOV и MARV
  5. HuH7
  6. R06E-J,
  7. Различия в ответах клеток-хозяев после инфекций EBOV и MARV
  8. Путь JAK / STAT
  9. Путь PPP1R15A
  10. Путь DUSP
  11. Различия в базовых уровнях экспрессии между линиями клеток человека и летучих мышей
  12. Сеть филовирусной инфекции

Различия в ранней скорости репликации вируса

Сравнивая уровни вирусной РНК в клетках HuH7 и R06E-J, мы определили, что EBOV и MARV реплицируются в HuH7 быстрее, чем в клетках R06E-J, между 3 и 7 ч. Pi синтез РНК замедлился у обоих видов в последующие 16 ч ( Рис. 3 ) и уровни стенограммы были почти идентичны на 23 час. Таблица S2 ). Вирусные белки EBOV и MARV были более многочисленными в HuH7, чем в клетках R06E-J при 7 часах пи и присутствовали на сходных уровнях при 23 часах пи ( Рис. 1C, D ) как определено с использованием IFA. Раннее повышение уровней вирусной РНК и белков в клетках HuH7 может быть объяснено более высокой скоростью ранней репликации филовирусов в клетках HuH7 по сравнению со скоростью в клетках R06E-J. Различия в скоростях репликации могут вносить вклад в различную восприимчивость клеток HuH7 и R06E-J к филовирусной инфекции. Однако это не объясняет, какие различия в механизмах клеточного регуляторного ответа ответственны за более высокую скорость синтеза РНК в клетках HuH7. Мы наблюдали несколько регуляторных эффектов при 3 и 7 ч пи. Однако более чем 1670 генов были повышены или понижены при 23 ч пи в EBOV-инфицированных клетках HuH7, тогда как только 74 гена показали измененные паттерны экспрессии в образцах, инфицированных MARV ( Рис. 4А ). Хемокиновые лиганды ( CXCL1 и CXCL5 ), факторы транскрипции (например, FOSL1 , FOS , FOSB , ATF3 ) и гены с различными функциями (например, PPP1R15A , фосфатазы с двойной специфичностью (DUSP)) были среди 55 генов, которые наиболее сильно регулировались после филовирусной инфекции в клетках HuH7 (log2 FC > 5, рисунок ES2A). Этот вывод подтверждается предыдущими сообщениями 11 , 14 , Каждый ген можно просмотреть вместе со всеми соответствующими подробностями на нашем веб-инструменте: www.rna.uni-jena.de/supplements/filovirus_human_bat/igo.php.

Рисунок 4: Значительно регулируемые гены в клетках, инфицированных EBOV или MARV.Рисунок 4: Значительно регулируемые гены в клетках, инфицированных EBOV или MARV

( A ) Количество строго регулируемых человеческих генов после заражения EBOV или MARV. Было только несколько генов, которые были значительно отрегулированы ( padj <0,1) через 3 и 7 ч pi в клетках, инфицированных EBOV и MARV, по сравнению с их экспрессией в клетках, обработанных Mock. Через 23 часа после введения количество регулируемых генов было выше (1 678) в клетках, инфицированных EBOV, чем в клетках, инфицированных MARV. Добавление этих ~ 1600 строго регулируемых генов к результатам анализов, сравнивающих различные временные точки или вирусы, привело к тому, что приблизительно 2500 генов были идентифицированы как существенно дифференцированные транскрибируемые. ( B ) Тепловая карта масштабированных в log2 разрядов изменений экспрессии в инфицированных образцах HuH7 и R06E-J против соответствующих образцов Mock (например, в третьем столбце показано кратное изменение между HuH7 Mock-обработанными клетками и HuH7 EBOV-обработанными клетками в 23 ч. пи). Входная матрица масштабируется в строках для визуализации изменений в экспрессии на уровне генов. Сложные изменения основаны на уникальных показателях считывания генома H. sapiens и R. aegyptiacus . Гены без четкой гомологичной последовательности в геноме или транскриптоме R. aegyptiacus помечены звездочкой. Мы идентифицировали гомологичные местоположения ( LOC107508087 , LOC107515336 , LOC107498547 ) для трех генов, которые не были непосредственно аннотированы в геноме R. aegyptiacus ( EP300 , RPS17L , MX1 ). Эти места были идентифицированы с использованием нашей сборки транскриптома de novo (красные прямоугольники). Мы указали молекулярную функцию каждого гена на основе цветовой схемы, представленной в ( D ). ( C ) Высоко регулируемые гены в EBOV- и MARV-инфицированных клетках HuH7 и R06E-J. FC - log2-кратное изменение на основе нормализованного числа считываний DESeq. Смотрите приложение ( Таблицы S5 а также S6 ) и соответствующие записи для подробной информации. ( D ) База данных PANTHER (v11.0) 96 был использован для назначения молекулярных функций каждому из 64 генов в ( B ). Далее мы разделили доминантную группу генов, которые мы определили, чтобы иметь общую функцию связывания. Во время филовирусных инфекций наиболее заметные регуляторные эффекты наблюдались для генов, кодирующих факторы транскрипции, которые регулируют пути NFκB и MAPK, их ингибиторы DUSP и факторы роста (рис. ES2A и Таблицы S5 а также S6 , полные таблицы в электронном приложении). Кроме того, изменения также наблюдались для генов, которые регулируют трансляцию белка ( RPS17 , PPP1R15A ), убиквитинирование ( TRAF6 , SQSTM1 ), аутофагоцитоз ( SQSTM1 ) и транспорт катионов ( CHAC1 , ATP2B4 ). Мы также наблюдали сильную активацию генов, которые участвуют в передаче энергии (например, RASGEF1B ). Подробности можно найти в Таблицы S5 – S8 ,

Дифференциальная экспрессия 2500 генов

Мы стремились ответить на три вопроса, основанных на уровнях транскрипции генов: (1) Что происходит во время филовирусной инфекции у хозяина? (2) Каковы различия в ответах клетки-хозяина между инфекциями EBOV и MARV? (3) Каковы различия в реакции клеток HuH7 и R06E-J после инфекций EBOV и MARV? Было обнаружено, что более 2500 дифференциально экспрессированных генов участвуют в реакции на филовирусные инфекции ( Таблицы S4 – S10 ). Наиболее значимые дифференциально экспрессируемые гены в ходе инфекций EBOV и MARV между клетками HuH7 и R06E-J включают гены факторов транскрипции, которые регулируют экспрессию киназ, а также их антагонистов и генов, участвующих в процессах убиквитинирования ( Рис. 4B ). Хотя мы подтвердили ранее сообщенную дисрегуляцию генов, вовлеченных в коагуляцию 11 , 12 , 14 они не были среди наиболее дифференцированно выраженных генов.

За исключением нескольких генов, мы подтвердили ранее наблюдавшиеся данные, основанные на микроматричном анализе EBOV-инфицированных клеток HuH7 12 , человеческие макрофаги 14 клетки макаки-резуса 13 и мышиные клетки 11 ,

Регуляция транскрипционных факторов

Было обнаружено, что многие транскрипционные факторы являются одними из самых дифференциально экспрессируемых генов. Поэтому мы предполагаем, что они играют важную роль в изменениях, наблюдаемых после филовирусной инфекции. Чтобы идентифицировать регуляторные факторы, которые ответственны за наблюдаемые изменения транскрипции после филовирусной инфекции в клетках HuH7, мы провели анализ ответа на активность мотива с помощью MARA. 47 , MARA делает вывод о регулирующем воздействии (также называемом активностью ) регуляторного мотива из изменений в экспрессии предсказанных нижестоящих генов (мишеней) этого мотива. Для кураторской коллекции ~ 190 мотивов, связывающих фактор транскрипции млекопитающих и ~ 90 miRNA семян, мы обнаружили 76 и 38 мотивов с изменением активности (значение z> 1,5) в ответ на инфекции EBOV и MARV соответственно (см. Электронный дополнение, раздел ES5 ). Гены, которые регулируются такими мотивами, участвуют в передаче сигналов NFκB или регуляции клеточного цикла ( Рис. 5 ). Интересно, что мы обнаружили, что мотив FOS / JUN значительно увеличил активность после инфекций EBOV и MARV. Этот результат указывает на то, что гены, имеющие сайты связывания FOS / JUN-мотив в их промоторной области, в основном активированы ( Рис. 5 ). В соответствии с этим, факторы транскрипции, которые связаны с этим мотивом (например, FOSB ), были повышены в инфицированных клетках ( Рис. 4B ). Транскрипционный фактор AP1 , гомо или гетеродимер дифференциально экспрессируемых FOS и JUN , играет важную роль в различных вирусных инфекциях 48 , 49 , Другие мотивы, такие как KLF12- и NRF1-ассоциированные мотивы ( Рис. 5 ), более специфичны для EBOV и MARV, соответственно, что отражает различия в воздействии этих двух вирусов на транскрипционный ландшафт инфицированных клеток. Таким образом, мы обнаружили, что различные мотивы, в том числе связанный с противовирусным сигналом мотив для NFκB , имеют значительные изменения в активности ( Рис. 5 ). Для каждого мотива мы предоставляем соответствующие регуляторы и гены-мишени (Раздел ES5).

Рисунок 5: Анализ ответа на действия мотива.Рисунок 5: Анализ ответа на действия мотива

В таблице показаны наиболее значимые мотивы после заражения клеток HuH7 EBOV (красный) или MARV (синий) по сравнению с ответом в контроле Mock. Предполагается, что регулируемые мотивы нацелены на (1) клеточный цикл (E2F1..5.p2) путем подавления CDC6 , PCNA и MCM6 ; (2) сигнализация NFκB (NFKB1_REL_RELA.p2) путем нацеливания на изоформы CXCL, изоформы ELF3 , NFκB , FOSL2 и JUN ; (3) экспрессия EGR1 в EBOV-инфицированных клетках (KLF12.p2, YY1.p2 и др.); или (4) организация хроматина в MARV-инфицированных клетках (NRF1.p2, YY1.p2 и др.). Для выбранных мотивов предполагаемые изменения активности (баллы +/− 1 SD) после заражения EBOV или MARV относительно соответствующих контролей Mock показаны для разных временных точек (3, 7 или 23 ч пи) рядом с таблицей и под ней. Выбранные регуляторные мотивы, связанные с ними гены и их важные цели (включая их кратное изменение между двумя временными точками) можно просмотреть в разделе ES5 и суммировать в файле ES5D.

Противовирусный ответ мРНК в основном не изменяется

Неожиданно, помимо влияния на факторы транскрипции, большинство генов и путей, которые имеют отношение к вирусным инфекциям, не продемонстрировали существенных регуляторных изменений в ответ на филовирусную инфекцию (Раздел ES6). Большинство генов участвуют в врожденных иммунных реакциях (от Kuri et al . 50 ) либо не экспрессировались в клеточных культурах человека, исследованных здесь, либо лишь слегка дифференцированно регулировались во время инфекции ( Таблица S11 ). В соответствии с этим наблюдением, некоторые из этих генов (например, IFITM1 / 2 , OAS1-3 ) не включены в нашу сборку транскриптома летучей мыши, что позволяет предположить, что они не были транскрибированы. Тем не менее, мы наблюдали значительно отличающиеся уровни РНК для нескольких гомологов летучих мышей генов врожденного иммунного ответа в филовирусных клетках R06E-J по сравнению с их уровнями в клетках HuH7. Например, DDX58 и ADAR продемонстрировали более низкие и NMI более высокие уровни экспрессии в EBOV-инфицированных клетках R06E-J ( Таблица S11 ). Различия в концентрациях мРНК этих транскриптов в инфицированных клетках HuH7 и R06E-J могут играть роль в защитных механизмах, которые активны во время филовирусных инфекций. Гены, кодирующие белки, инициирующие пути, которые, как известно, отвечают на вирусные инфекции, такие как DDX58 (рисунок ES6.8), NFκB (рисунки ES6.10 и ES6.17) и пути MAPK (рисунки ES6.2–6.7), не индуцировались во время филовирусных инфекций в нашем исследовании. Только те гены изученных путей, которые кодируют белки, выступающие в качестве ключевых игроков (см. Рис. 4B, C ) были повышены в EBOV-инфицированных клетках HuH7 относительно их экспрессии в клетках R06E-J.

Вирусный белок Эбола VP35 ингибирует передачу сигналов DDX58 , которая определяет исход инфекции в клетках человека 51 , 52 , 53 , Мы исследовали путь DDX58 , который индуцирует активацию ISRE3 , AP1 (FOS и JUN ), NFκB и интерферона β в клетках. 54 , 55 (Рисунок ES6.8). Хотя мы наблюдали различия между клетками HuH7 и R06E-J в уровнях мРНК DDX58 и ISYNA1 , все, кроме одного гена ( IKKε ), связанного с путем DDX58, были экспрессированы, но они не подвергались дифференциальному влиянию. Мы отметили положительную регуляцию генов FOS (38X) и JUN (9X) в EBOV-инфицированных клетках HuH7 через 23 ч pi ( Рис. 4B ). Мы не наблюдали значительного изменения генов, специфичных для пути DDX58 на транскриптомном уровне. Поэтому мы предполагаем, что регуляция пути DDX58 на транскриптомном уровне не является движущим фактором, приводящим к частым смертельным случаям, наблюдаемым у людей, которые не наблюдаются у летучих мышей, после филовирусной инфекции.

Мы исследовали связь белка DDX58 с другими белками на уровне мРНК, такими как TRIM25 , который взаимодействует с путем DDX58 56 , Белки семейства TRIM индуцируются интерферонами и участвуют в противовирусных клеточных реакциях 57 , Мы обнаружили, что у нескольких членов семейства TRIM повышенная регуляция в клетках, инфицированных EBOV, происходила между 3–7 часами после приема, но была снижена с 7 до 23 часов после еды ( Таблица S12 ). Соответствующие гомологи летучих мышей либо не экспрессировались (например, TRIM71 ), либо существенно не дифференцировались между клетками R06E-J и HuH7 (например, TRIM25 ).

В соответствии с предыдущими отчетами 58 наши результаты показывают, что филовирусы не вызывают и не блокируют апоптоз (рис. ES6.33), так как гены, вовлеченные в апоптоз, не были существенно регулируются во время инфекций EBOV или MARV, за исключением BBC3 , который был повышен в 9,6 раза у EBOV-инфицированных Клетки HuH7. Однако важно отметить, что обе клеточные линии были увековечены, что может объяснить минимальное влияние на гены, вовлеченные в апоптоз.

Большинство генов хозяина демонстрируют сходную реакцию после заражения EBOV и MARV

Общая реакция EBOV- и MARV-инфицированных клеток HuH7 через 3 часа была аналогична реакции в клетках R06E-J через 7 часов ( Рис. 6 ). Зависимый от охвата гена график иллюстрирует большую скорость репликации вируса в клетках HuH7 по сравнению со скоростью в клетках R06E-J. На этот ответ могут влиять процессы прикрепления и проникновения вируса. Мы исследовали различия и сходства во время филовирусной инфекции в клетках HuH7 и R06E-J.

Рисунок 6: Распространенные закономерности генной регуляции после филовирусной инфекции.Рисунок 6: Распространенные закономерности генной регуляции после филовирусной инфекции

Диаграммы рассеяния демонстрируют кратные изменения экспрессии, определяемые с помощью DESeq кодирующих и некодирующих РНК в клетках, инфицированных MARV и EBOV, по сравнению с экспрессией в контрольных образцах Mock через 3, 7 и 23 ч после заражения EBOV и MARV. Мы наблюдали сходные паттерны экспрессии в клетках HuH7 через 3 часа после инъекции и в линии клеток летучей мыши через 7 часов после еды, что позволяет предположить, что прогрессирование инфекции филовирусом происходит медленнее в клетках R06E-J. Диаграмма рассеяния, полученная из анализа дифференциальной экспрессии клеток HuH7 при 23 ч пи, показывает большое количество дифференциально экспрессированных генов. Подробное представление о фигурах (включая гены за пределами диапазона отложенных изменений) можно найти в электронном виде. дополнение, рисунок ES4B , Гены, демонстрирующие сходную экспрессию после инфицирования EBOV и MARV и abs (log2 ( FC ))> 1, отмечены красным. Черная линия: у = х; Пунктирная линия: линия регрессии.

HuH7

Мы определили, что большинство генов хозяина реагировали сходным образом в ответ на инфекции EBOV и MARV, что может объяснить общие симптомы, вызываемые этими вирусами у людей. CYR61 был одним из наиболее активированных генов в клетках HuH7 и обычно был высоко экспрессирован через 3 и 23 ч пи, что соответствует периодам воспаления и заживления раны, соответственно 59 (Рисунок ES4C). Гены цитокинов IL8 и IL32 реагировали как в MARV-, так и в EBOV-инфицированных клетках HuH7, демонстрируя значительную повышающую регуляцию ( Рис. 4B ). Экспрессия IL32 может быть индуцирована IL8 и участвует в апоптозе Т-клеток у пациентов, инфицированных EBOV 60 , 61 , Он также активируется в ответ на инфекции вирусом гриппа А. Повышенная регуляция IL8 приводит к активации провоспалительных путей 62 , 63 , Мы определили активацию NRAV 7 ч пи. Об этой длинной некодирующей РНК недавно сообщили, что она является ключевым регулятором противовирусного врожденного иммунитета, который действует путем подавления стимулированной интерфероном транскрипции генов. 64 , Мы предполагаем, что существует клеточный компонент, помимо филовирусного ингибирования врожденной иммунной системы VP24 и VP35. 65 , 66 , 67 , 68 , 69 , что приводит к такому же ингибированию врожденного иммунитета. В 23 часа после рождения мы определили несколько генов с высокой и пониженной регуляцией, которые мы не смогли классифицировать (см. Раздел ES4). Мы также определили, что ANXA3 был заметно повышен . Аннексин А3 является ингибитором фосфолипазы А2 и обладает антикоагулянтными свойствами 70 ,

Наши данные указывают на начальный воспалительный ответ (3 ч пи) 50 с последующей репрессией противовирусной защиты (7 ч пи) с большей частью понижающей и пониженной экспрессии генов, происходящей в 23 ч пи в клетках HuH7 ( Рис. 6 ).

R06E-J,

Клетки R06E-J по-разному реагировали на филовирусные инфекции, чем клетки HuH7. Через 3 часа после начала исследования мы определили нарушения ядерных рецепторов, участвующих в пролиферации и дифференцировке клеток (например, NR4A3 71 ) и регулирующая клеточный цикл убиквитинлигаза ANAPC10 , которая контролирует прогрессирование через митоз 72 , BLCAP , который контролирует пролиферацию клеток, апоптоз и клеточный цикл 73 был также подавлен в 3 ч пи HAVCR1 (ранее известный как TIM-1 ), который был понижен в 7 ч пи, является рецептором для многих вирусов, включая филовирусы 74 и вирус денге 75 , Мы наблюдали, что различные гистоновые гены (например, HIST1H2B6 , HIST1H1C ) были подавлены при 23 пи. Это может быть эпигенетическим сигналом, который может вызывать гибель клеток. NPR3 также подавлялся в клетках R06E-J через 23 ч после заражения фоловирусом. Этот ген участвует в регуляции объема и давления крови, сердечной функции и некоторых метаболических и ростовых процессах. 76 , Дополнительную информацию о значительной ко-регуляции генов, происходящих во время филовирусной инфекции в клетках HuH7 и R06E-J, можно найти в разделе ES4.

Эти данные могут описать основные различия между клетками человека и летучей мыши, которые возникают при заражении филовирусом.

Различия в ответах клеток-хозяев после инфекций EBOV и MARV

Из 35 исследованных путей (Рисунки ES6.2–6.33) пути JAK / STAT, PPP1R15A и DUSP продемонстрировали значительную дифференциальную регуляцию во время инфекции ( Рис. 7 ). Тем не менее, эти пути не продемонстрировали одинаковую активность при инфекциях EBOV и MARV, и ответы этих путей не могут объяснить общие симптомы заболевания 9 индуцируется обоими вирусами.

Рисунок 7: Влияние филовирусных инфекций на пути JAK / STAT, PPP1R15A и DUSP.Рисунок 7: Влияние филовирусных инфекций на пути JAK / STAT, PPP1R15A и DUSP

(A) Путь JAK / STAT. Путь JAK / STAT демонстрирует общую тенденцию в уровнях экспрессии: STAT1 , STAT2 и JAK2 были повышены (↑) между 3 и 7 ч пи, а затем понижены (↓) между 7 и 23 ч пи в EBOV-инфицированном HuH7 клетки. Цитокиновый рецептор IFNGR2 не регулируется между 3 и 7 часами (=) и демонстрирует 2-кратную повышающую регуляцию между 7 и 23 часами (2 ↑) (рис. ES6.22). (B) Путь PPP1R15A . Остановка роста и повреждение ДНК 34 ( GADD34 , официально известный как PPP1R15A ) могут быть быстро вызваны несколькими типами клеточного стресса. В клетках R06E-J PPP1R15A был слегка повышен (в 2 раза) из-за инфекции EBOV через 23 часа; в клетках HuH7 мы наблюдали сильную повышающую регуляцию (45Х) в клетках, инфицированных EBOV, и отсутствие повышающей регуляции в клетках, инфицированных MARV. (C) Путь DUSP. DUSP1 , 8 и 10 демонстрируют наибольшую специфичность для MAPK ( MAPK14 и MAPK8 ). DUSP1 локализован в ядре, тогда как DUSP8 и DUSP10 также доступны в цитозоле. Считается, что ядерные DUSP являются индуцибельными фосфатазами. 87 и последствия DUSP во время вирусных инфекций были продемонстрированы для DUSP1 , который активируется во время вируса Эпштейна-Барр 97 и вирусные инфекции коровьей оспы 88 , В ответ на вирус коровьей оспы DUSP1 активно участвует в противовирусных контрмерах клетки-хозяина посредством регуляции фосфорилирования MAPK. Легенда. Коробки указывают на повышение / понижение регуляции от 3 до 7 ч и от 7 до 23 ч пи в EBOV-инфицированных клетках HuH7 (красный); MARV-инфицированные клетки HuH7 (зеленые); и EBOV-инфицированные клетки R06E-J (синие). Для случаев, когда уровень экспрессии изменился более чем на 15%, стрелка указывает направление регулирования (↑ / ↓). Когда уровень экспрессии изменился более чем на 100% (двукратное изменение транскрипции), число рядом со стрелкой указывает на кратное изменение. «=» Указывает на изменение выражения <15%. Квадраты вокруг названий генов указывают на дифференциальную экспрессию в клеточной линии HuH7 (красная), между EBOV- и MARV-инфицированными клетками (зеленая) и между клетками HuH7 и R06E-J (синяя).

Путь JAK / STAT

В EBOV-инфицированных клетках HuH7 все гены, кодирующие членов пути JAK / STAT, были слегка индуцированы между 3 и 7 ч pi ( Рис. 7А ). Однако система JAK / STAT в клетках R06E-J продемонстрировала лишь минимальный ответ на инфекции EBOV и MARV. EBOV белок VP24 оказывает негативное влияние на передачу сигналов STAT1 77 , 78 , 79 и было обнаружено, что STAT1 / 2 подавляется через 23 ч по сравнению с их экспрессией через 7 ч pi в клеточной линии HuH7. Нижестоящие гены в этом пути, такие как EP300 и PIM1 , были высоко активированы в 23 часа на уровне мРНК в EBOV-инфицированных клетках HuH7 ( Рис. 4B ). мРНК сигнального рецептора IFNGR2 была повышена , а мРНК взаимодействующего JAK2 подавлена ​​через 23 часа после инъекции в EBOV-инфицированных клетках HuH7. Эта регуляция может быть связана с активацией обратной связи от PIM1 через CISH к рецептору IFNGR2 80 , 81 на уровне белка.

Инфекции MARV запускают иную реакцию в клетках HuH7, чем инфекции EBOV: мРНК PIM1 и рецептор IFNGR2 подавляются ( Рис. 7А ). Самое поразительное, хотя в настоящее время мы не знаем, взаимодействует ли VP24 с STAT1 у летучих мышей, полный путь JAK / STAT в основном не затрагивается на уровне мРНК во время инфекций EBOV в клетках R06E-J (рис. ES6.22).

Путь PPP1R15A

Экспрессия PPP1R15A была заметно повышена в EBOV -инфицированных клетках HuH7, но лишь незначительно индуцирована в филовирусных клетках R06E-J ( Рис. 4B ). В настоящее время мы не знаем, как активность PPP1R15A связана с инфекциями EBOV или MARV. Рисунок 7B выдвигает на первый план эту крайнюю дифференциальную экспрессию (45Х), которая предполагает, что этот ген может быть ранее неопознанным ключевым игроком в ответе EBOV-инфицированных клеток HuH7.

Для MARV-инфицированных клеток HuH7 и R06E-J мы не обнаружили такого огромного изменения уровней мРНК PPP1R15A . PPP1R15A участвует в регуляции запрограммированной гибели клеток 82 и гены, вовлеченные в апоптоз, не были дерегулированы (рис. ES6.33), что может быть связано с тем, что в этих экспериментах использовались только иммортализованные клеточные линии. Другой важной активностью PPP1R15A является контроль отрицательной обратной связи, который он оказывает на фосфорилирование eIF2α , которое регулирует трансляцию белка 83 , EIF2α не был значительно дифференцированно выражен в наших образцах (рис. ES6.12). Протеинкиназа R, которая фосфорилирует eIF2α , была слегка повышена и понижена в клетках, инфицированных EBOV и MARV, соответственно. Возможно, что ранее описано ингибирование mTOR посредством PPP1R15A 84 , 85 отвечает за тот факт, что путь mTOR не был обнаружен как активный в клеточных линиях HuH7 и R06E-J, инфицированных филовирусом (Figure ES6.26).

Путь DUSP

Наиболее поразительное различие между EBOV-инфицированными клетками HuH7 и R06E-J наблюдалось среди мРНК, кодирующих различные DUSP, что представляет собой возможный ключ к контрастным врожденным иммунным ответам клеток человека и летучих мышей 86 , 87 ( Рис. 7C ). У клеток, инфицированных вирусом коровьей оспы, наблюдается повышенная экспрессия DUSP1. 88 и EBOV-инфицированные человеческие макрофаги 14 , DUSPs являются критическими регуляторами нескольких клеточных путей, потому что они ингибируют гены центрального иммунного активатора, такие как MAPK8 , MAPK14 и MAPK1 / 3 (также известный как ERK2 / 1 ). 87 , В то время как уровни экспрессии этих трех генов иммуноактиватора существенно не изменились pi, следует отметить резкую активацию при 23 часах pi генов DUSP в клетках HuH7 (до 25X), но не в клетках R06E-J (до 3X).

Мы предполагаем, что следующая последовательность событий происходит во время инфекций EBOV. После инвазии EBOV в клетки-хозяева индуцируется противовирусный ответ, включая активацию NFκB и MAPK. Гены других путей врожденного иммунного ответа (например, JAK / STAT, DDX58 ) затем подавляются. После заражения EBOV DUSPs сильно повышается в клетках HuH7, что коррелирует с понижающей регуляцией уровней мРНК MAPK8 , MAPK1 / 3 и MAPK14 . При переводе эти гены отвечают за врожденный иммунный ответ 89 , PPP1R15A играет центральную роль, связываясь с рецептором TGFBR1 и ингибируя дополнительные компоненты врожденной иммунной системы. По сравнению с клетками HuH7 клетки R06E-J демонстрируют почти полное отсутствие или только очень небольшую активацию PPP1R15A и DUSP, что, вероятно, приводит к стабильному противовирусному ответу. Кроме того, уровни мРНК всех генов пути JAK / STAT в клетках R06E-J остаются постоянными во время EBOV-инфекции по сравнению с уровнями в клетках HuH7. Вирусный белок VP24 ингибирует активность STAT1 у людей, блокируя передачу сигналов в ядро. Мы предполагаем, что существует возможная петля обратной связи, которая увеличивает количество рецепторов IFNGR2 в клетках HuH7. Надежная экспрессия генов, стимулированных интерфероном, может управлять противовирусным ответом инфицированной клетки 90 ,

Различия в базовых уровнях экспрессии между линиями клеток человека и летучих мышей

Чтобы проверить количество считываний, полученных из RNA-Seq, и наблюдаемые различия в уровнях базовой экспрессии определенных генов между клеточными линиями HuH7 и R06E-J, мы провели анализ qRT-PCR для предполагаемых рецепторов EBOV NPC1. 91 и HAVCR1 92 и Toll-подобный рецептор TLR3 на образцах Mock и EBOV 3 и 23 ч pi (раздел ES7). Мы сравнили нормализованные по уровням 18S уровни мРНК этих генов (Файл ES7B) с подсчетами считывания, полученными из RNA-Seq, из клеток человека и летучих мышей и обнаружили сильную общую корреляцию. По нашим данным, все три гена экспрессируются в обеих клеточных линиях. Мы наблюдали, что NPC1 явно более распространен в клетках HuH7, чем в клеточной линии R. aegyptiacus . TLR3 экспрессируется на более высоком уровне в клетках R06E-J, чем в клеточной линии человека, но также не экспрессируется дифференциально. Эти результаты подтверждают наши данные RNA-Seq. Интересно, что мы наблюдали различия в кривых плавления для TLR3 и HAVCR1 (рисунок ES7B), что могло быть связано с различиями в амплифицированных последовательностях РНК человека и летучей мыши, поскольку идентичные вырожденные праймеры использовались для амплификации TLR3 из HuH7 и R06E-J. клетки. Для экспрессии HAVCR1 мы наблюдали небольшое подавление между 3 и 23 часами пи в клетках R06E-J. Тем не менее, необходимы дальнейшие исследования с различными клеточными линиями и первичными клетками.

Мы наблюдали явные различия в базовой экспрессии некоторых генов между клеточными линиями HuH7 и R06E-J. Тем не менее, мы избежали осложнений, которые могут возникнуть из-за этой проблемы при сравнении гомологичных генов человека и летучей мыши, сосредоточившись на вычисленных log2-кратных изменениях вместо непосредственного сравнения количества считываний.

Сеть филовирусной инфекции

При анализе связей на уровне белка среди сотен генов, значительно повышающих активность, в отношении связей на уровне транскрипции и в отношении различий в анализируемых путях наблюдались многие специфические и иногда удивительные отношения между ключевыми игроками. Мы определили обширную и сложную сеть взаимодействующих генов хозяина, которые могут объяснить летальный исход инфекций EBOV и MARV. Мы суммировали гены, которые значительно регулируются на уровне мРНК в «сети инфекций филовируса», показанной в Рис. 8 , Показанные соединения основаны на известных взаимодействиях белок / белок из литературы. Мы суммировали различия между различными временными точками в течение инфекций в клетках HuH7 и R06E-J, а также между инфекциями EBOV и MARV. Это краткое изложение не является полным, потому что несколько жестко регулируемых генов, таких как SKP2 , которые ингибируют CDKN1B , CYCE и CDKN1A, не были связаны в нашей сети с филовирусной инфекцией, вероятно, из-за отсутствия информации в литературе. При исследовании других путей, таких как те, которые включают MAPK, NFκB , фокальную адгезию или TGFβ , мы наблюдали, что части путей, которые были активны в ядре, были дифференцированно регулируются между клетками HuH7 и R06E-J во время филовирусных инфекций.

Рисунок 8: Сеть заражения филовирусами.Рисунок 8: Сеть заражения филовирусами

Ключевые игроки EBOV и MARV в клетках HuH7 и R06E-J на уровне транскрипции и их взаимодействия на уровне белка. Мы объединили значительные дифференциально экспрессируемые гены из известных путей и литературы. Почти все крайне дерегулированные ключевые игроки наиболее значимых путей этого исследования (например, MAPK, NFκB , JAK / STAT и DUSP) являются частью этой сети с инфекцией филовирусами. Мы не можем соединить все гены (например, SKP2, ингибирующие CDKN1B , CYCE и CDKN1A ). Мы обнаружили, что семь членов пути DUSP ( DUSP1 , 4 , 5 , 6 , 8 , 10 и 16 ) сильно дерегулированы и участвуют во многих взаимодействиях, в основном подавляя MAPK8 , MAPK1 / MAPK3 и MAPK14 . Мы обнаружили, что несколько факторов транскрипции (например, FOS , JUN , ATF3 ) активируются во время инфекции EBOV на высоких уровнях. Cilloniz et al . выполнил глобальный анализ экспрессии генов образцов селезенки мышей, зараженных различными адаптированными к мыши EBOV 11 , Здесь мы в основном подтверждаем результаты для клеток HuH7. Желтый фон - рецепторы и связанные с ними белки; синий фон - ядерные белки; красные прямоугольники - значительная дифференциальная экспрессия в клетках HuH7 между 3, 7 и 23 часами; зеленые поля - значимое дифференциальное выражение между EBOV и MARV; синие прямоугольники - значительная дифференциальная экспрессия между клетками HuH7 и R06E-J. Подробную картину, описания генов и генные правила можно посмотреть на рисунке ES6.1.

Каковы различия в ответах клетки-хозяина между инфекциями EBOV и MARV?
Каковы различия в реакции клеток HuH7 и R06E-J после инфекций EBOV и MARV?